儀器： BI-200SMBI-MwA
使用 BI-200SM 測量蛋白質(zhì)樣品的分子量
摘要
靜態(tài)光散射（SLS）能夠測量多分散材料以及具有離散聚集數(shù)樣品（如蛋白質(zhì)）的平均分子量。合成聚合物本質(zhì)上是多分散的，非常適合使用這種技術(shù)進(jìn)行直接分析，用平均分子量來更為直觀地表示。以牛血清白蛋白（BSA）為例，這種蛋白質(zhì)有三種異構(gòu)體（分子量分別為 66.5kDa 、133 kDa 和 200 kDa），此時(shí)平均分子量的含義可能就沒那么清晰。通過將使用傳統(tǒng)靜態(tài)光散射法在廣角光散射系統(tǒng)上測量的分子量與通過尺寸排阻色譜（SEC）實(shí)驗(yàn)得到的相對(duì)豐度進(jìn)行比較，可以說明這種關(guān)系的性質(zhì)。
引言
牛血清白蛋白（BSA）是一種易于獲取的蛋白質(zhì)，常被用作更復(fù)雜蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)藥物的替代品。眾所周知，在生理 pH 值和離子強(qiáng)度附近，BSA 處于三種具有明確聚集數(shù)的異構(gòu)體（單體、二聚體、三聚體，N agg 分別為 1, 2, 3）的平衡狀態(tài)。雖然動(dòng)態(tài)光散射（DLS）技術(shù)很難解決這些問題，但還是存在一定的可能性。而靜態(tài)光散射（SLS）由于不具備分辨能力，只能得到一個(gè)單一的平均分子量。
結(jié)果
這種表達(dá)方式（圖 1）被稱為 Zimm 圖 ，它需要進(jìn)行濃度和角度依賴的光強(qiáng)測量。 Zimm 圖 是一種多角度、多濃度的外推法，分別外推至零角度和零濃度。測量的濃度分別為 10 mg/mL、3 mg/mL 和 2 mg/mL，散射角度為 θ = 60°、75°、90°、105° 和 120o。測得的平均分子量約為 81 kDa，這個(gè)值對(duì)于 BSA 單體（66.5 kDa ）而言太大，但又明顯低于二聚體（133 kDa）或三聚體（200 kDa）。為了理解這一點(diǎn)，必須考慮到 BSA 單體與多聚體始終處于平衡狀態(tài)。
單體 ? 二聚體 ? 三聚體
對(duì)于已知材料（在本例中為蛋白質(zhì)），其折光指數(shù)與濃度之間的關(guān)系是已知的。如果該物質(zhì)的折光指數(shù)增量（dn/dc）已知，就可以確定其絕對(duì)濃度。
dn/dc 是折射率（ns）對(duì)濃度作圖并外推至零濃度時(shí)的斜率。其中，ns 是溶液的折射率。該斜率在很寬的濃度范圍內(nèi)通常呈線性，因此極限斜率往往與稀溶液條件下的斜率相同。
這類似于在已知摩爾消光系數(shù)的條件下，通過在 280 nm 處的紫外吸光度測量來確定濃度。在下面所示的色譜實(shí)驗(yàn)（圖2）中，初始濃度是已知的，因此即使沒有任何外部校準(zhǔn)，也可以確定每種物質(zhì)的相對(duì)豐度。
微分折光指數(shù)（圖2）與濃度成正比，因此可以從數(shù)量上對(duì)各組分（單體和二聚體）的相對(duì)含量進(jìn)行量化。雖然認(rèn)為存在三聚體，但由于其含量過低，僅通過折光指數(shù)無法識(shí)別。在知道 BSA 單體和二聚體的相對(duì)濃度后，就有可能進(jìn)一步評(píng)估上文單獨(dú)使用 SLS 測量的結(jié)果（圖1）。通過對(duì)光散射中固有的光強(qiáng)權(quán)重的理解，可以根據(jù)這些組分的相對(duì)含量來估算平均分子量。
請(qǐng)注意，雖然通過示差（RI，圖 2）只能識(shí)別出二聚體和單體，但 MALS 圖譜（圖3）能清晰地識(shí)別出三聚體、二聚體和單體。在此，三個(gè)峰的相對(duì)面積隨散射角度而變化，其中最大的分子在小角度下的散射最為強(qiáng)烈。這種量化方法用于探究不同權(quán)重的影響，并將其與圖 1 中得到的分子量進(jìn)行比較。
平均分子量（MW）通過以下表達(dá)式計(jì)算得出：
單體 N=1 = 66.5 kDa
二聚體 N=2 = 2×66.5 kDa = 133 kDa
三聚體 N=3 = 3×66.5 kDa = 200 kDa
平均分子量（MW）= ( X% 單體 × 66.5 kDa ) + ( Y% 二聚體 × 133 kDa ) + ( Z% 三聚體 × 200 kDa )
表1 – 基于各組分（N=1、2 和 3）相對(duì)豐度預(yù)測的平均分子量。
| 平均分子量計(jì)算依據(jù) | 單體分子量（kDa） | 單體 | 二聚體 | 三聚體 | 平均分子量（kDa） |
|---|---|---|---|---|---|
| MALS 130 度角下的光強(qiáng)加權(quán) | 66.5 | 80.8% | 13.5% | 5.7% | 83.0 |
| MALS 105 度角下的光強(qiáng)加權(quán) | 66.5 | 80.0% | 13.6% | 6.5% | 84.1 |
| MALS 90 度角下的光強(qiáng)加權(quán) | 66.5 | 78.7% | 13.6% | 7.7% | 85.7 |
| RI 信號(hào)的數(shù)量加權(quán) | 66.5 | 89.1% | 10.9% | 0.10% | 74.0 |
示差信號(hào)能夠直接反映給定材料的濃度，而散射光強(qiáng)則是分子量與濃度共同作用的結(jié)果。因此，僅基于光強(qiáng)加權(quán)的分子量會(huì)高估較大分子（特別是二聚體和三聚體）的貢獻(xiàn)?；叵胍幌拢瑔为?dú)使用 SLS 測得的分子量約為81 kDa，這與表 1 所示基于光強(qiáng)加權(quán)得到的分子量結(jié)果非常接近。
總結(jié)
- 蛋白質(zhì)中通常有多種具有不同聚集數(shù)的組分處于平衡狀態(tài)（以 BSA 為例，聚集數(shù) N agg分別為1、2、3）。
- 從 Zimm 圖獲得的任何分子量都是這三種異構(gòu)體的平均值。
- 當(dāng)與色譜分離方法（在本案例中為 GPC）聯(lián)用時(shí)，折光指數(shù)可用于測量不同分子量組分的相對(duì)豐度。
- 使用以下兩種方法計(jì)算平均分子量相對(duì)簡單：（i）光強(qiáng)加權(quán)；（ii）數(shù)量加權(quán)。
結(jié)論
靜態(tài)光散射可用于測量多分散樣品（包括蛋白質(zhì)）的分子量。生物樣品通常具有明確的聚集數(shù)（單體、二聚體等）。在平衡控制的自締合情況下（如蛋白質(zhì)二聚化），各組分非常明確，因此分子量將是彼此的整數(shù)倍。本文探討了多組分體系中靜態(tài)光強(qiáng)、分子量和相對(duì)濃度之間的關(guān)系。
參考文獻(xiàn)
- Zimm, Bruno H., “Apparatus and Methods for Measurement and Interpretation of the Angular Variation of Light Scattering”, J. Chem. 16, 1099 (1948).
- J. C. Moore, “Gel permeation chromatography. I. A new method for molecular weight distribution of high polymers”, J. Polym. Sci., A-2, 835 (1964).
- Weiner, Bruce B., “Let There Be Light: Characterizing Physical Properties of Colloids, Nanoparticles & Proteins Using Light Scattering”, Amazon, (2019).